Change search
ReferencesLink to record
Permanent link

Direct link
Attempt to purify and identify an unknown cytochrome c in Ideonella dechloratans
Karlstad University, Faculty of Health, Science and Technology (starting 2013).
2013 (English)Independent thesis Advanced level (degree of Master (Two Years)), 20 credits / 30 HE creditsStudent thesisAlternative title
Försök att rena fram och identifiera ett okänt cytokrom c i Ideonella dechloratans (Swedish)
Abstract [en]

Oxochlorates are compounds consisting of chlorine and oxygen and are in high concentrations toxic to mammals and the environment. They exist and can be formed naturally but most of the oxochlorates in the environment are a result of human activities, for example the paper industry. Bacteria capable of growth anaerobically with (per)chlorate as terminal electron acceptor in its respiratory chain are utilized to purify the waste water. One of those bacteria is Ideonella dechloratans, which uses chlorate reductase to reduce chlorate into chlorite and then chlorite dismutase to decompose chlorite into chlorine and molecular oxygen.

Present work deals with detection and purification of c cytochromes in I. dechloratans that could have a role in electron transport during chlorate reduction. Earlier work has demonstrated the presence of two major periplasmic c cytochromes with apparent molecular weights around 6 and 13 kDa. These have been purified and characterized. The "6 kDa protein" was shown to be capable of donating electrons to chlorate reductase and terminal oxidase in vitro. The molecular weight as determined by mass spectrometry analysis was shown to be 9.4 kDa. The "13 kDa protein" was shown to be unable to act as an electron donor directly to chlorate reductase in vitro. Attempts with mass spectrometry analysis has yet been unsuccessful.

In this study, attempts were made to purify this 13 kDa cytochrome c from anaerobically cultivated I. dechloratans to investigate its properties with 2D electrophoresis and if possible, cut out a spot and analyze it with mass spectrometry.

Some purification was achieved with cationic exchange chromatography, where about 10 other proteins were eluted at the same time as the 13 kDa cytochrome c. Further purification attempts had difficulties with the detection of the cytochrome c on SDS-PAGE. It is less likely, but still possible, that this was due to protein degradation or loss of the heme group. Fractions containing the 13 kDa cytochrome c were analyzed with 2D electrophoresis but the protein could not be detected on the gel. This is probably due to the protein having difficulties entering the IPG strip during the rehydration in the first dimension or difficulties transferring from the strip into the gel in the second dimension. Different changes, such as a low voltage applied over the strip during rehydration and increased carrier ampholyte concentration, were made to the protocol but did not help. Attempts to verify if the problem is in the first or second dimension were made but did not show anything.

Abstract [sv]

Oxoklorater är föreningar bestående av klor och syre och de är i höga halter giftiga för miljö och däggdjur. De finns och kan skapas naturligt men av det som finns i naturen har den största delen tillförts av människan genom utsläpp från t ex pappersbruk. För att rena avloppsvatten från (per)klorater används bakterier som kan leva anaerobt med (per)klorat som terminal elektronacceptor i respirationskedjan. En sådan bakterie är Ideonella dechloratans, som använder kloratreduktas för att reducera klorat till klorit och sedan kloritdismutas för att bryta ner klorit till klor och molekylärt syre.

Nuvarande forskning fokuserar på att detektera och rena fram c cytokromer i I. dechloratans som kan medverka i elektrontransporten vid kloratreduktion. Tidigare studier har visat förekomsten av bland annat två periplasmiska c cytokromer med apparenta molekylvikter kring 6 och 13 kDa. "6 kDa proteinet" har visats kunna donera elektroner till kloratreduktas och terminal oxidas in vitro. Molekylvikten bestämdes med masspektrometrianalys till 9,4 kDa. "13 kDa proteinet" har visats inte kunna donera elektroner direkt till kloratreduktas in vitro. Försök att analysera proteinet med masspektrometri har hittills inte lyckats.

I denna studie gjordes försök att rena fram 13 kDa c-cytokromet från anaerobt odlade I. dechloratans för att undersöka dess egenskaper med 2D-elektrofores och om möjligt skära ut en fläck och analysera med masspektrometri.

Efter ett reningssteg med katjonbyteskromatografi erhölls viss rening där ett tiotal andra proteiner eluerades ut samtidigt som 13 kDa c-cytokromet. Vid efterföljande reningsförsök uppstod problem vid detektering av proteinet med SDS-PAGE. Det är mindre troligt, men fortfarande möjligt, att det berodde på degradering av proteinet eller att det tappat sin hemgrupp. Fraktioner innehållande 13 kDa c-cytokromet analyserades med 2D-elektrofores men proteinet kunde inte upptäckas på gelen. Troligtvis beror detta på att det antingen har problem att ta sig in i IPG-strippen i första dimensionen eller att det har svårt att ta sig från stripp till gel i andra dimensionen. Olika ändringar i utförandet såsom svag spänning över strippen under rehydrering och ökad bäraramfolytkoncentration hjälpte inte. Försök att ta reda på om problemet ligger i första eller andra dimensionen gjordes men visade inget.

Place, publisher, year, edition, pages
2013. , 39 p.
Keyword [sv]
cytokrom c, Ideonella dechloratans, FPLC
National Category
Biochemistry and Molecular Biology
URN: urn:nbn:se:kau:diva-28257Local ID: KE:1OAI: diva2:632938
Subject / course
Available from: 2013-07-01 Created: 2013-06-25 Last updated: 2013-07-01Bibliographically approved

Open Access in DiVA

fulltext(1846 kB)603 downloads
File information
File name FULLTEXT01.pdfFile size 1846 kBChecksum SHA-512
Type fulltextMimetype application/pdf

By organisation
Faculty of Health, Science and Technology (starting 2013)
Biochemistry and Molecular Biology

Search outside of DiVA

GoogleGoogle Scholar
Total: 603 downloads
The number of downloads is the sum of all downloads of full texts. It may include eg previous versions that are now no longer available

Total: 230 hits
ReferencesLink to record
Permanent link

Direct link