Change search
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf
Interstrand Crosslinks - Induction and repair
Stockholm University, Faculty of Science, Department of Genetics, Microbiology and Toxicology. (Team Jenssen)
2012 (English)Doctoral thesis, comprehensive summary (Other academic)
Abstract [en]

DNA crosslinking agents exhibit a variety of DNA lesions, such as monoadducts, DNA-DNA interstrand or intrastrand crosslinks or DNA-protein crosslinks. Agents that produce interstrand crosslinks (ICLs) exist naturally and are widely used in chemotherapy. Therefore, it is important to understand how the lesions induced by these agents are repaired. In bacteria, the repair is mainly dependent on nucleotide excision repair (NER) together with homologous recombination (HR) or translesion synthesis (TLS). In human cells, it is not clear how these lesions are repaired, and it is believed to be a more complicated process in which NER does not play as important a role as in prokaryotes. Here, we investigated the repair mechanisms mainly after treatment with psoralen but also with acetaldehyde, cisplatin and mitomycin C in some studies. As expected from studies on plasmids and in bacteria, we used new techniques to confirm that various ICL-inducing agents block replication fork elongation in mammalian cells. We also found that the replication fork was unable to bypass these lesions. We confirmed that ERCC1/XPF and the HR proteins BRCA2 and XRCC2/3 are vital for protection against ICL treatments. These proteins were also found to be equally important for the repair of monoadducts. To better understand ICL repair in mammalian cells, we developed a method to study the induction and unhooking of ICL in human fibroblasts. We found that ICLs were repaired and that 50% of the induced ICLs were unhooked within 3 hours following exposure. Additionally, we determined that XPA, but not XPE, is involved in ICL unhooking, although not affecting lethality. A step in ICL repair is the formation of double-strand breaks (DSBs), and we identified a replication-dependent formation of DSBs following ICL treatment. Furthermore, ERCC1/XPF was not necessary for DSB formation. The repair of these DSBs was performed by HR and involved ERCC1/XPF. Additionally, we were able to quantify the ICL unhooking in human fibroblasts and found that they can unhook ~2500 ICL/h. We also determined that a dose of approximately 400 ICL/cell is lethal to 50% of the cells, indicating that ICL unhooking is not the most critical step during the repair process.

Abstract [sv]

DNA-skadande ämnen är vanligt i cancerbehandling, då snabbt växande celler, såsom cancerceller är betydligt känsligare än normala celler för DNA skador. En grupp av ämnen som vanligen används i cancerbehandling är korsbindare av DNA. Dessa ämnen kommer reagera två gånger med DNA och skapa två bindningar mitt emot varandra. DNA strängen, som består av två delar, måste kunna separeras och kopieras (replikation) på ett tillförlitligt sätt för att cellerna ska kunna dela sig och bli flera. DNA strängen måste också kunna dela sig och bli avläst rätt för att nya proteiner ska kunna bildas (transkription). När korsbindarna har bundit till DNA strängarna, hindrar detta deras separation och därigenom förhindras även avläsningen och kopieringen.  För att göra undersökningarna av DNA korsbindande ämnen ännu lite svårare, så ger korsbindare flera olika typer av skador. Dels kan det bli flera olika typer av korsbindningar, både mellan två DNA-strängar (ICL) vilket är den farligaste och mest svårreparerade typen, men det kan också ske inom samma DNA-sträng (intrastrand crosslink) eller mellan en DNA-sträng och ett protein (DNA-protein crosslink). Korsbindare kan även bilda enbindningsskador (monoaddukt), vilket innebär den bara binder en gång till DNA.

För att cellen ska kunna överleva, så måste den reparera skadorna och ta bort korsbindningen eller monoaddukten. Hur detta sker i människor är inte helt klarlagt men det verkar som det sker i flera steg. Till att börja med klipps DNA sönder i ena strängen på båda sidorna om korsbindningen, detta gör att den kvarvarande delen av korsbindningen kan böjas bort. Därefter kommer cellen att skapa nytt DNA för att fylla mellanrummet som bildats. Cellen använder sig av den andra DNA strängen som mall för att sätta in rätt DNA baser, men i fallet med korsbindande ämnen så är även den strängen skadad och därför finns det en stor risk för att fel DNA baser sätts in och då uppstår mutationer. Nästa steg är att klippa den kvarvarande delen av korsbindningen, även denna gång skapas ett mellanrum som måste fyllas med nya baser.

Den första artikeln i avhandlingen handlar om att försöka reda ut om det är ICLen eller monoaddukten som är orsak till olika effekter som påträffas efter behandling med korsbindande ämnen. Det vi fann var att även om det bara var från ICLs som vi kunde mäta en effekt på replikationen, så fick vi nästan lika stark effekt från monoaddukterna, som från ICL, för en av de vanligast använda markörerna (kännetecknen) för båda DNA strängarna var brutna på samma ställe (dubbelstränsbrott). Detta berodde dock inte på att även monoaddukterna skapade dubbelsträngsbrott, utan på att markören vi använde var ospecifik. Vi fann även att även om ICLs har mycket större effekt än monoaddukten på cellens överlevnad m.m., så kan man inte bortse ifrån effekten av monoaddukten och att den troligen har en betydande roll för de korsbindande ämnen som endast ger en liten del ICLs.

I artikel två har vi utvecklat en ny metod, som gör det möjligt att mäta hur många ICLs som bildas vid en viss dos av de korsbindande ämnen vi undersöker. Vi kan även mäta hur fort ICLerna kan repareras i mänskliga celler med hjälp av metoden. Tack vare en kombination av våra mätningar och med hjälp av datorsimuleringar, kunde vi räkna ut hur många ICLs som bildades per dos för tre vanliga korsbindare. Vi kunde även visa att 50 % av ICLen har påbörjat reparationen och kommit så långt att de var bortklippta från ena stängen inom 3 timmar efter behandlingen.

I artikel tre undersöker vi vilka proteiner som är inblandade i den tidiga delen av ICL reparationen, alltså fram till och med att celler klipper ut korsbindningen på båda sidorna om skadan i ena strängen. Här visar vi att celler som är defekta i reparationsprotein kallat XPA, har en betydligt långsammare borttagning av ICLer än vad båda normala celler och celler defekta i reparationsprotein XPE har. Vi visar även att detta inte påverkar cellens replikationshastighet, eller har någon effekt på cellens överlevnad.

Den fjärde artikeln handlar om acetaldehyd, som bildas när alkohol förbränns i kroppen. Acetaldehyd har föreslagits bilda ICL och därför undersökte vi vilka effekter den har på cellerna. Vi visar i den här artikeln att det krävs nysyntes av DNA för att acetaldehyd ska leda till dubbelsträngsbrott. Celler kan reparera dessa dubbelsträngsbrott med hjälp av reparationssystem, som kallas homolog rekombination, men att reparationen ibland blir felaktig.

I den femte och sista artikeln i avhandligen undersöker vi ett av de vanligast föreslagna proteinen för att sköta klippningen av DNA (ERCC1/XPF) och hur den är inblandad i reparationen av korsbindningar. Vi kan här visa att även det krosbindande ämnet mitomycin C bromsar replikationshastigheter och att ERCC1/XPF är nödvändigt för att kunna fullfölja homolog rekombination av ICLs.

Place, publisher, year, edition, pages
Stockholm: Department of Genetics, Microbiology and Toxicology, Stockholm University , 2012. , 90 p.
Keyword [en]
ICL, DNA repair, interstrand crosslink, psoralen
National Category
Biochemistry and Molecular Biology
Research subject
Molecular Genetics
Identifiers
URN: urn:nbn:se:su:diva-78797ISBN: 978-91-7447-546-3 (print)OAI: oai:DiVA.org:su-78797DiVA: diva2:545126
Public defence
2012-09-21, Magnélisalen, Kemiska övningslaboratoriet, Svante Arrhenius väg 16 B, Stockholm, 10:00 (English)
Opponent
Supervisors
Note

At the time of the doctoral defense, the following papers were unpublished and had a status as follows: Paper 1: Submitted. Paper 2: Manuscript. Paper 3: Manuscript. Paper 4: Submitted.

Available from: 2012-08-30 Created: 2012-08-13 Last updated: 2012-08-22Bibliographically approved
List of papers
1. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells
Open this publication in new window or tab >>DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells
Show others...
(English)In: DNA Repair, ISSN 1568-7864, E-ISSN 1568-7856Article in journal (Refereed) Submitted
National Category
Biochemistry and Molecular Biology
Research subject
Molecular Genetics
Identifiers
urn:nbn:se:su:diva-78799 (URN)
Available from: 2012-08-13 Created: 2012-08-13 Last updated: 2017-12-07Bibliographically approved
2. The quantification and repair of psoralen-induced interstrand crosslinks in human cells
Open this publication in new window or tab >>The quantification and repair of psoralen-induced interstrand crosslinks in human cells
Show others...
(English)Manuscript (preprint) (Other academic)
National Category
Other Biological Topics
Research subject
Molecular Genetics
Identifiers
urn:nbn:se:su:diva-78809 (URN)
Available from: 2012-08-13 Created: 2012-08-13 Last updated: 2012-08-20Bibliographically approved
3. XPA has a key role in the unhooking step of ICL repair in intact mammalian cells
Open this publication in new window or tab >>XPA has a key role in the unhooking step of ICL repair in intact mammalian cells
(English)Manuscript (preprint) (Other academic)
National Category
Other Biological Topics
Research subject
Molecular Genetics
Identifiers
urn:nbn:se:su:diva-78810 (URN)
Available from: 2012-08-13 Created: 2012-08-13 Last updated: 2012-08-20Bibliographically approved
4. Genotoxicity of alcohol is linked to DNA replication-associated damage and homologous recombination repair
Open this publication in new window or tab >>Genotoxicity of alcohol is linked to DNA replication-associated damage and homologous recombination repair
Show others...
(English)In: Carcinogenesis, ISSN 0143-3334, E-ISSN 1460-2180Article in journal (Refereed) Submitted
National Category
Other Biological Topics
Research subject
Molecular Genetics
Identifiers
urn:nbn:se:su:diva-78808 (URN)
Available from: 2012-08-13 Created: 2012-08-13 Last updated: 2017-12-07Bibliographically approved
5. The ERCC1/XPF endonuclease is required for completion of homologous recombination at DNA replication forks stalled by inter-strand cross-links
Open this publication in new window or tab >>The ERCC1/XPF endonuclease is required for completion of homologous recombination at DNA replication forks stalled by inter-strand cross-links
Show others...
2009 (English)In: Nucleic Acids Research, ISSN 0305-1048, E-ISSN 1362-4962, Vol. 37, no 19, 6400-6413 p.Article in journal (Refereed) Published
Abstract [en]

Both the ERCC1-XPF complex and the proteins involved in homoIogous recombination (HR) have critical roles in inter-strand cross-link (ICL) repair. Here, we report that mitomycin C-induced lesions inhibit replication fork elongation. Furthermore, mitomycin C-induced DNA double-strand breaks (DSBs) are the result of the collapse of ICL-stalled replication forks. These are not formed through replication run off, as we show that mitomycin C or cisplatin-induced DNA lesions are not incised by global genome nucleotide excision repair (GGR). We also suggest that ICL-lesion repair is initiated either by replication or transcription, as the GGR does not incise ICL-lesions. Furthermore, we report that RAD51 foci are induced by cisplatin or mitomycin C independently of ERCC1, but that mitomycin C-induced HR measured in a reporter construct is impaired in ERCC1-defective cells. These data suggest that ERCC1-XPF plays a role in completion of HR in ICL repair. We also find no additional sensitivity to cisplatin by siRNA co-depletion of XRCC3 and ERCC1, showing that the two proteins act on the same pathway to promote survival.

National Category
Biochemistry and Molecular Biology
Research subject
Molecular Genetics
Identifiers
urn:nbn:se:su:diva-32005 (URN)10.1093/nar/gkp705 (DOI)000271389900010 ()19713438 (PubMedID)
Available from: 2009-12-02 Created: 2009-12-02 Last updated: 2017-12-12Bibliographically approved

Open Access in DiVA

fulltext(1502 kB)885 downloads
File information
File name FULLTEXT01.pdfFile size 1502 kBChecksum SHA-512
c557efa161a026673808a4e581d52065d233114c9b34d12cc009c7ea5dab3650c98abed1c358b11e2c3ac8c2f221f9fe551aa8f246ce0cea11ea2725530f7c44
Type fulltextMimetype application/pdf

Search in DiVA

By author/editor
Vare, Daniel
By organisation
Department of Genetics, Microbiology and Toxicology
Biochemistry and Molecular Biology

Search outside of DiVA

GoogleGoogle Scholar
Total: 885 downloads
The number of downloads is the sum of all downloads of full texts. It may include eg previous versions that are now no longer available

isbn
urn-nbn

Altmetric score

isbn
urn-nbn
Total: 328 hits
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf