Although it has been long known that pH plays an important role in biology, it was only in the 20th century that people first realized that pH can greatly affect the structure and function of proteins on a molecular level. A commonly encountered problem when studying the effect of pH in proteins is that experimental techniques such as X-ray crystallography and cryogenic electron microscopy often lack the resolution required to determine the protonation states of titratable residues. Even with neutron diffraction methods, which can theoretically resolve protons, the electrostatic environment in a crystal or grid does not necessarily correspond to the cellular environment. Where experimental methods fall short, in silico approaches such as molecular dynamics (MD) simulations can provide additional insight. However, pH is not typically captured dynamically in classical MD simulations. Rather, the protonation states of titratable sites such as aspartic and glutamic acid are usually set at the start of the simulation and remain constant throughout the run. Despite significant efforts in theMDfield to model protonation more realistically, a comprehensive and efficient constant-pH implementation in GROMACS has so far been lacking.

The aim of this work was to implement a continuous constant-pH method in GROMACS, to improve the ease of use of such methodology for the GROMACS user community, and to apply such methodology to study pH-gated ion channels. To this end, the work presented in this thesis can be divided into three parts. First, in papers I and II, I discuss the implementation of a λ-dynamics-based constant-pH algorithm in GROMACS, including several important methodological aspects. Next, in paper III, I present phbuilder, a Python-based simulation builder tool that automates the often complicated, tedious, and error-prone set up process of constant-pH simulations in GROMACS. Finally, in papers IV and V, I investigate how the constant-pH method can be used to better understand the pH gating mechanism in the bacterial GLIC and sTeLIC ligand-gated ion channels.

The work presented in this thesis has contributed to both the methodological and application sides in the field of MD. I have helped to develop and implement a λ-dynamics based constant-pH method in GROMACS, and I have made such methodology available to the broader GROMACS user community by providing a tool that automates its setup process. On the application side, I have demonstrated the feasibility of the constant-pH implementation for studying large and complex protein systems, such as ion channels, and furthered our understanding of pH-mediated gating in GLIC and sTeLIC.

Även om det länge har varit känt att pH spelar en viktig roll inom biologin, var det först under 1900-talet som människor insåg att pH kan ha stor påverkan på vilken struktur och funktion proteiner har på molekylär nivå. Ett vanligt problem vid studier av pHs effekt på proteiner är att experimentella tekniker, såsom röntgenkristallografi och kryoelektronmikroskopi, ofta saknar den upplösning som krävs för att bestämma protoneringsstadierna hos titrerbara aminosyror. Även med neutronspridningsmetoder, som teoretiskt sett har tillräcklig upplösning för att detektera enskilda protoner, motsvarar inte den elektrostatiska miljön i en kristall eller gitter nödvändigtvis den cellulära miljön. Där experimentella metoder inte räcker till kan in silico-tekniker som molekyldynamik (MD)-simuleringar ge ytterligare insikter. Dock fångas pH normalt sett inte dynamiskt in i klassiska MD-simulationer. Istället sätts protoneringsstadierna för titrerbara platser som asparagin- och glutaminsyra vanligtvis i början av simulationen och förblir konstanta under hela simulationen. Trots betydande ansträngningar inom MD-området för att modellera protonering mer realistiskt har en heltäckande och effektiv konstant-pH-implementering i GROMACS hittills saknats.

Syftet med detta arbete var att implementera en kontinuerlig konstant-pH-metod i GROMACS, att förbättra användarvänligheten för sådan metodik för GROMACS-användare och att tillämpa en sådan metodik för att studera pH-styrda jonkanaler. Utifrån detta kan arbetet som presenteras i denna avhandling delas in i tre delar. Först diskuterar jag i artikel I och II implementeringen av en λ-dynamikbaserad konstant-pH-algoritm i GROMACS, samt flera viktiga metodologiska aspekter. Därefter presenterar jag i artikel III phbuilder, ett Python-baserat verktyg för simuleringsgenerering som automatiserar den ofta komplicerade, omständliga och felbenägna processen att konfigurera konstant-pH-simulationer i GROMACS. Slutligen undersöker jag i artikel IV och V hur konstant-pH-metoden kan användas för att bättre förstå pH-styrningsmekanismen hos de bakteriella jonkanalerna GLIC och sTeLIC.

Arbetet som presenteras i denna avhandling har bidragit till både metodologiska och tillämpade aspekter inom MD-området. Jag har hjälpt till att utveckla och implementera en λ-dynamikbaserad konstant-pH-metod i GROMACS, och jag har gjort en sådan metodik tillgänglig för den bredare GROMACS-användargruppen genom att tillhandahålla ett verktyg som automatiserar dess installationsprocess. På den tillämpade sidan har jag visat genomförbarheten av konstant-pH-implementeringen för att studera stora och komplexa proteinsystem, såsom jonkanaler, och vidareutvecklat vår förståelse för pH-medierad gating hos GLIC och sTeLIC.

Hoewel het al lange tijd bekend is dat pH een belangrijke rol speelt in de biologie, realiseerde men zich pas in de 20e eeuw voor het eerst dat pH een grote invloed kan hebben op de structuur en functie van eiwitten op moleculair niveau. Een veelvoorkomend probleem bij het bestuderen van het effect van pH op eiwitten is dat experimentele technieken zoals röntgenkristallografie en cryogene elektronenmicroscopie vaak niet de benodigde resolutie bieden om de protonatietoestanden van titreerbare aminozuren te bepalen. Zelfs met neutrondiffractiemethoden, die in theorie protonen kunnen onderscheiden, komt de elektrostatische omgeving in een kristal of rooster niet noodzakelijk overeen met de celomgeving. Waar experimentele methoden tekortschieten, kunnen molecular dynamics (MD) simulaties aanvullend inzicht bieden. pH wordt echter doorgaans niet dynamisch vastgelegd in traditionele MD-simulaties. In plaats daarvan worden de protonatietoestanden van titreerbare aminozuren meestal aan het begin van de simulatie ingesteld en blijven constant tijdens de run. Ondanks aanzienlijke inspanningen in het MD-veld om protonatietoestanden realistischer te modelleren, ontbrak tot nu toe een moderne en efficiënte constant-pH-implementatie in GROMACS.

Het doel van dit proefschrift was om een continue constant-pH-methode te implementeren in GROMACS, om de gebruiksvriendelijkheid voor de GROMACS gebruikersgemeenschap te verbeteren, en om deze methodologie toe te passen om pH-gemoduleerde ionkanalen te bestuderen. Eerst bespreek ik in papers I en II de implementatie van een λ-dynamica-gebaseerd constant-pH-algoritme in GROMACS, inclusief verschillende belangrijke methodologische aspecten. Vervolgens presenteer ik in paper III phbuilder, een op Python gebaseerde system builder tool die het vaak ingewikkelde, tijdrovende en foutgevoelige instelproces van constant-pH-simulaties in GROMACS automatiseert. Ten slotte onderzoek ik in papers IV en V hoe de constant-pH-methode kan worden gebruikt om de pH-modulatie in de bacteriële GLIC- en sTeLIC-ligandgestuurde ionkanalen beter te begrijpen.

Het werk in dit proefschrift heeft bijgedragen aan zowel de methodologische als de toepassingsgerichte aspecten op het gebied van MD. Ik heb geholpen bij de ontwikkeling en implementatie van een λ-dynamica-gebaseerde constant-pH-methode in GROMACS, en ik heb deze methodologie beschikbaar gemaakt voor de GROMACS-gebruikersgemeenschap door een tool te ontwikkelen die het instelproces automatiseert. Aan de toepassingskant heb ik de haalbaarheid van de constant-pH-implementatie aangetoond voor het bestuderen van grote en complexe eiwitsystemen zoals ionkanalen, en ons begrip van de pH-gating in GLIC en sTeLIC vergroot.