Biological variations are being explored at ever-increasing rates through the rapid advancement of analytical techniques. Techniques like massively parallel sequencing empower scientists to accurately differentiate individuals’ genetic compositions, cellular functionalities, and healthy tissue from diseased. The knowledge gained from these techniques brings us ever closer to grasping the complexities of life, contributing to human development. Still, to fully elucidate biological variations in different samples requires novel sensitive and high- throughput techniques, capable of placing everything in its correct context. One such technique gaining promise is droplet barcoding. 

Droplet barcoding leverages emulsion droplets to segregate samples into their functional components, coupled with barcodes that can group tagged molecules following sequencing. This technique constitutes a versatile tool for studying biological variations in both the phenotype and genotype. This thesis leverages droplet barcoding to explore variations relating to human biology. 

Droplet barcoding was used to study phenotype variations, looking at protein compositions in single extracellular vesicles (Paper I) and single cells (Paper II). Paper I studies extracellular vesicles which are naturally released from cells. They carry heterogeneous protein signatures that can inform about their cellular origin. Tens of thousands of extracellular vesicles were profiled, including approximately 25,000 from lung cancer patients. From these protein profiles, extracellular vesicles could be grouped into putative subtypes. Paper II presents a novel method for studying single cells which was used to characterize blood-derived immune cells. The method enabled the identification of most major immune cell lineages. 

Haplotype-resolved genetic variations were analyzed using a linked read sequencing method based on droplet barcoding. Linked-read sequencing conserves long-range information from short-read sequencing by co- barcoding subsections of long DNA fragments. Paper III presents an open-source pipeline (BLR) for whole genome haplotyping using linked reads. BLR generates accurate and continuous haplotypes, outperforming PacBio HiFi-based diploid assembly. We further show that integration with low-coverage long-read data can improve phasing accuracy in tandem repeats. With 10X Genomics linked reads, BLR generated more continuous haplotypes compared to other workflows. Paper IV applies linked read sequencing to reveal the haplotype complexities of cancer genomes. In two patients with colorectal cancer, we identified several large-scale aberrations impacting cancer-related genes. Additionally, several short somatic variants were found to impact nearly all oncogenic networks identified by TCGA. Demonstrating the importance of haplotype-resolved analysis for cancer genomics, one patient exhibited two nonsense mutations on separate haplotypes in the well-known colorectal cancer gene APC. 

Biologiska variationer utforskas i allt snabbare grad, pådrivet av den snabba utvecklingen av analytiska tekniker. Tekniker som massiv parallellsekvensering möjliggör för forskare att noggrant särskilja individers genetiska sammansättningar, cellernas olika funktioner och frisk vävnad från sjuk. Vetskapen dessa tekniker medför ger oss allt djupare insikter om livsformers komplexitet som främjar mänsklig utveckling. Torts dessa framsteg kräver klarläggandet av biologiska variationer i olika prover nya känsliga tekniker med hög kapacitet, kapabla att placera information i dess rätta sammanhang. En särskilt lovande teknik är droppkodning. 

Droppkodning utnyttjar emulsionsdropparnas förmåga att separera prover i dess funktionella komponenter kombinerat med DNA-koder för att gruppera märkta molekyler efter sekvensering. Denna teknik utgör ett mångsidigt verktyg för att studera biologiska variationer i både fenotyp och genotyp. Den här avhandlingen utforskar tekniker baserat på droppkodning för att analysera dessa variationer relaterat till människlig biologi. 

Droppkodning användes i analys av fenotypvariationer genom att studera proteinsignaturer hos enskilda extracellulära vesiklar (Artikel I) samt enskilda celler (Artikel II). Artikel I studerar extracellulära vesiklar, vilka är partiklar som naturligt släpps ut från celler. Dessa vesiklar bär på heterogena protein-signaturer som kan informera om dess cellulära härkomst. I studien undersöks proteinsignaturer från tiotusentals extracellulära vesiklar, inklusive cirka 25 000 från lungcancerpatienter. Utifrån dessa signaturer kunde extracellulära vesiklar sedan grupperas i potentiella subtyper. Artikel II presenterar en ny metod för att studera enskilda celler, som användes för att karakterisera immunceller från blod. Metoden möjliggjorde identifiering av de flesta stora immuncellspopulationerna. 

Haplotyp-upplösta genotypvariationer analyserades med en metod för länkad sekvensering baserad på droppkodning. Länkad sekvensering möjliggör att vid sekvensering med kort läslängd bevara information över långa genomiska distanser genom DNA-kodning av små delar av långa DNA-fragment. Artikel III presenterar en pipeline (BLR) med öppen källkod för helgenoms haplotypning som använder data från länkad sekvensering. BLR genererar haplotyper med stor exakthet och kontinuitet som överträffar diploid genom-sammansättning (“assembly”) med PacBio HiFi data. Vi visar även att integrering med långa sekvenser med begränsad genomtäckning förbättra haplotypning i tandem-repetitiva genomregioner. Med 10X Genomics länkade sekvenser genererade BLR mer kontinuerlig haplotypning jämfört med andra analysflöden. Artikel IV tillämpar länkad sekvensering för att avslöja haplotypkomplexiteten hos cancergenom. Hos två patienter med tjocktarmscancer identifierades flera storskaliga variationer som överlappar cancerrelaterade gener. Dessutom hittades flera korta somatiska varianter som påverkade gener i nästan all onkogena nätverk identifierade av TCGA. En patient uppvisade två nonsensmutationer på separata haplotyper i den välkända tjocktarmscancergenen APC, vilket påvisar vikten av haplotyp-upplöst analys för cancergenomik. 

Antibodies and affinity proteins are essential tools in research, diagnostics and therapy. Antibodies have the ability to bind to a large variety of protein targets with great specificity and selectivity, allowing them to be used for identification, or targeted therapy of devastating diseases such as cancer. Bioconjugation to other molecules enables the extension of antibody function, enhancing its capabilities beyond recognition and binding. By attachment of a cytotoxic molecule such as a cytotoxic drug or a radionuclide to the antibody, a cell-killing agent can be directly delivered to the cancer cells, eliciting localized effect and sparing healthy tissues. Selecting a suitable labelling technique to produce high-quality antibody conjugates is a crucial consideration for many applications. Site-specific labelling is an attractive approach, where the cargo is directed to a predefined location on the antibody, resulting in homogeneous and well-characterized conjugates, without impacting its tumour antigen binding properties. Many different methods have been explored; affinity-based strategies serve as the basis of this thesis. Ligands such as the Protein A- derived Z domain and the FcIII peptide bind to the Fc domain on the antibody framework, a suitable location for delivering a selected payload. 

In this thesis, I have explored affinity ligand-based and glycan engineering-based site-specific antibody labelling methods for the production of antibody conjugates for therapeutic purposes and as research tools. In Papers I-II, we adopted site-specific labelling methods based on the Fc- targeting ligands Z domain and FcIII peptide along with a glycan-modification approach for the preparation of antibody conjugates for radioimmunotherapy (RIT) purposes. Our methods resulted in well-characterized conjugates covalently labelled with a chelator suitable for radiolabelling. The radioimmunoconjugates were evaluated in vivo and showed great potential for future applications in RIT. 

In Paper III, we aimed to improve an earlier developed PNA-based antibody pretargeting system by adopting different labelling strategies for the production of antibody-PNA conjugates. Such systems hold great potential to increase the uptake of radioactivity in the tumour and decrease exposure of healthy tissues to radiation as well as improve imaging contrast for radioimaging. Here, we demonstrated that by carefully reengineering of both the primary and secondary targeting agents, considerable enhancement can be achieved with PNA-based pretargeting. 

Apart from their success as therapeutic and diagnostic agents, antibody conjugates are widely established reagents in basic research. As sequencing-based single-cell protein expression analysis assays are becoming more popular, the production of high-quality antibody-oligonucleotide conjugates gains high importance. In such assays, specific antibody-targeted antigens are identified following the amplification and next-generation sequencing of their corresponding barcodes. In Paper IV, we utilize the Z domain for decorating an antibody panel targeting key immune cell markers with unique barcodes. The barcoded antibodies were used in DBS-Pro, a high-throughput and multiplex single-cell protein analysis method. In this project, DBS-Pro was applied for the identification of major immune cell subpopulations in PBMC samples. i In Paper V, we explored as an alternative to RIT, the potential of using affinity ligands based on endogenous peptides for radionuclide therapy. The short peptide RM26, targeting the cancer antigen gastrin-releasing peptide receptor (GRPR), commonly overexpressed in prostate cancer, is a promising candidate for imaging and therapy. Being a short peptide, RM26 suffers from fast blood clearance, which is a challenge for the therapeutic application of such ligands. Our approach to overcome this issue and to extend the circulatory half-life of RM26 is to conjugate the peptide to an albumin-binding domain (ABD) that can bind to HSA, the most abundant protein in our blood, thus achieving prolonged blood residence time. By designing, producing and evaluating several ABD-RM26 conjugate variants, we were able to investigate the effect of molecular composition on the biodistribution and bioavailability of such molecules, and identifying candidates with the most favourable properties for future development. 

In conclusion, in this thesis I combined recombinant protein techniques with chemical synthesis to produce unique protein conjugates followed by their in vitro and in vivo characterization to evaluate functional and biophysical properties. The experimental work presented in this thesis provides a rationale for the development of novel bioconjugates for a variety of future applications. 

Antikroppar och affinitetsproteiner är viktiga verktyg inom forskning, diagnostik och terapi. Antikroppar har förmågan att binda till en mängd olika proteintarget med stor specificitet och selektivitet, vilket gör att de kan användas för identifiering eller riktad terapi av förödande sjukdomar såsom cancer. Biokonjugering med andra molekyler möjliggör utvidgning av antikroppsfunktionen, vilket förbättrar dess kapacitet bortom igenkänning och bindning. Genom att fästa en cytotoxisk molekyl som ett cytotoxiskt läkemedel eller en radionuklid till antikroppen kan ett cellförstörande reagens levereras direkt till cancercellerna, vilket ger en lokaliserad effekt och skonar friska vävnader. Att välja en lämplig inmärkningsmetod för att producera högkvalitativa antikroppskonjugat är en avgörande faktor för många tillämpningar. Platspecifik inmärkning är ett attraktivt tillvägagångssätt där lasten riktas till en fördefinierad plats på antikroppen, vilket resulterar i homogena och välkarakteriserade konjugat utan att påverka dess tumörantigenbindande egenskaper. Många olika metoder har undersökts; affinitetsbaserade strategier utgör grunden för denna avhandling. Ligander som Z-domänen, som härrör från Protein A, och FcIII-peptiden binder till Fc-domänen på antikroppsstrukturen, en lämplig plats för att leverera en utvald last. 

I denna avhandling utforskar jag affinitetsligand-baserade och glykankonstruerade platspecifika antikroppsinmärkningsmetoder för produktion av antikroppskonjugat för terapeutiska ändamål och som forskningsverktyg. I arbete I-II använder vi platspecifika inmärkningsmetoder baserade på de Fc-bindande liganderna Z och FcIII tillsammans med en glykanmodifieringsmetod för framställning av antikroppskonjugat för radioimmunoterapi (RIT). Våra metoder resulterade i välkarakteriserade konjugat kovalent märkta med en kelator lämplig för radioinmärkning. Radioimmunokonjugaten utvärderades in vivo och visade stor potential för framtida tillämpningar inom RIT. 

I arbete III syftade vi till att förbättra ett tidigare utvecklat PNA-baserat antikroppsadministrationssystem genom att använda olika inmärkningsstrategier för produktion av antikropps-PNA-konjugat. Sådana system har stor potential att öka upptaget av radioaktivitet i tumören och minska exponeringen av friska vävnader för strålning samt förbättra bildkontrasten vid molekylär avbildning. Här visade vi att genom noggrann modifiering av både de primära och sekundära reagensen kan betydande förbättringar uppnås med PNA-baserad leverans av radioaktivitet. 

Förutom deras framgång som terapeutiska och diagnostiska medel är antikroppskonjugat väletablerade reagenser inom grundforskning. När sekvenseringsbaserade singelcellproteinexpressionsanalyser blir allt mer populära blir produktionen av högkvalitativa antikropps-oligonukleotidkonjugat av stor betydelse. I sådana analyser identifieras specifika antikroppsbundna antigen efter amplifiering och sekvensering av deras motsvarande streckkoder. I arbete IV använde vi Z-domänen för att dekorera en antikroppspanel riktad mot viktiga immuncellmarkörer med unika streckkoder. De streckkodade antikropparna användes i DBS-Pro, en multiplex-singelcellproteinanalysmetod med hög genomströmning. I detta projekt tillämpades DBS-Pro för identifiering av större immuncellsubpopulationer i PBMC-prover. iii I arbete V utforskade vi som ett alternativ till RIT möjligheten att använda affinitetsligander baserade på endogena peptider för radionuklidterapi. Den korta peptiden RM26, riktad mot cancerantigenet gastrin-releasing peptide receptor, som vanligtvis överuttrycks i prostatacancer, är en lovande kandidat för avbildning och terapi. Som en kort peptid lider RM26 av snabb blodclearance, vilket är en utmaning för den terapeutiska tillämpningen av sådana ligander. Vårt tillvägagångssätt för att övervinna detta problem och förlänga cirkulationstiden för RM26 är att konjugera den med en albuminbindande domän (ABD) som kan binda till HSA, det mest förekommande proteinet i vårt blod, och därmed uppnå förlängd uppehållstid i blodet. Genom att designa, producera och utvärdera flera ABD-RM26-konjugatvarianter kunde vi undersöka effekten av molekylär sammansättning på biodistributionen och biotillgängligheten av sådana molekyler samt identifiera kandidater med de mest gynnsamma egenskaperna för framtida tillämpningar. 

Sammanfattningsvis använde jag i denna avhandling rekombinant proteinteknik kombinerat med kemisk syntes för att producera unika proteinkonjugat följt av karakterisering in vitro och in vivo för att utvärdera deras funktionella och biofysikaliska egenskaper. Det experimentella arbetet som presenteras i denna avhandling ger en grund för utvecklingen av nya biokonjugat för mångsidiga framtida tillämpningar.